Габариты строительные леса: Строительные леса – размеры секции и другие параметры + Видео

6KG

3.3kg

3.0Kg

2,8кг

3.2kg

xG1

xG1

23KG

2.4kg

2.0KG

1.8KG

1.7kg

9050 Регулируемая основная рама Винтовой Джек Base

9012-25

2 кг

Стойка ограждения основной рамы

масштабируемые «тканевые нити» без каркаса в качестве новой биочернилы

Материалы и изготовление альгинатных капсул

Перед приготовлением раствора гидрогеля порошок альгината натрия и хлорида кальция (CaCl ₂ ) (Sigma Aldrich, Великобритания) обрабатывали ультрафиолетовый (УФ) свет для стерилизации (три 30-минутных цикла).Стерилизованный порошок альгината натрия растворяли в стерильной деионизированной воде с получением 4% (мас. / Об.) Раствора альгината. Раствор альгината подвергали перемешиванию магнитной мешалкой до достижения гомогенности. 4% раствор CaCl ₂ был использован в качестве сшивающего агента во время метода коаксиальной экструзии (как подробно показано на дополнительном рис. 1a), что облегчило создание трубчатых альгинатных капсул с одинаковым размером и формой из нетоксичных, недорогих и гибкий альгинат. Система изготовления состояла из самодельного коаксиального сопла (дополнительные методы S1 для изготовления сопла), соединенного с пневматическим дозатором воздуха (EFD Nordson, США) и механического насоса (New Era Pump System Inc., США) для экструзии альгината и CaCl ₂ соответственно. Узел коаксиального сопла состоял из внутреннего сопла 22 G (0,71 мм и 0,41 мм для внешнего и внутреннего диаметров, соответственно) и внешнего сопла 14 G (2,11 мм и 1,69 мм для внешнего и внутреннего диаметров, соответственно). Давление подачи альгината было установлено на 82,7 кПа, в то время как скорость подачи CaCl ₂ была установлена ​​на уровне 16 мл / мин. Предварительно сшитые альгинатные трубчатые капсулы экструдировали в пул CaCl ₂ и оставляли на ночь для полного сшивания.

Клеточный препарат

Свежие коленные суставы молодого взрослого крупного рогатого скота (в возрасте 15–24 месяцев) были получены с местной бойни (Bud’s Custom Meats, Riverside, IA). Суставной хрящ собирали из мыщелка бедренной кости и промывали сбалансированным солевым раствором Хэнка (HBSS, Life Technologies, Калифорния, США) с добавлением 100 Ед / мкл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 2,5 мкг / мкл фунгизона (Invitrogen Life Technologies, Карлсбад). , Калифорния). Образцы хряща полной толщины измельчали ​​на мелкие кусочки, а затем переваривали в течение ночи с помощью 0.25 мг / мл коллагеназы типа I и проназы E (1: 1) (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) растворяли в культуральной среде в инкубаторе с встряхиванием в течение ночи (по 0,25 мг / мл каждая). После выделения первичные хондроциты повторно высевали и культивировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) и F12 Хэма (смесь 1: 1) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (Life Technologies, Гранд-Айленд, штат Нью-Йорк), 50 мкг / мкл. -аскорбат, 100 Ед / мкл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 2,5 мкг / мкл фунгизона при 37 ° C с 5% CO ₂ .

Изготовление тканевых нитей

Первичные хондроциты размножались до тех пор, пока не было достигнуто желаемое количество, а затем собирались для образования большой клеточной массы. Клетки сначала суспендировали в культуральной среде и центрифугировали при 2000 об / мин в течение 10 минут с образованием клеточной массы на дне конической пробирки на 50 мл. Затем клеточную массу (осадок клеток) инкубировали при 37 ° C с 5% CO ₂ в течение ночи в среде на основе DMEM в статических условиях культивирования с 2% фетальной бычьей сывороткой, дополненной 10 мкг / мкл пенициллина, 10 мкг / мл. стрептомицин и 2.5 мкг / мкл фунгизона (Invitrogen Life Technologies, Карлсбад, Калифорния), чтобы иметь достаточную адгезионную способность и механическую целостность для дальнейшей обработки. На следующий день осадок клеток аспирировали с помощью специального шприца (Hamilton Company, Reno, NV) (дополнительный рис. 2а) и осторожно вводили в трубчатые каналы. Трубчатые каналы использовались в качестве полупроницаемых капсул для агрегации клеток путем связывания концов сосудистыми зажимами (Thomas Scientific, Swedesboro, NJ). Полупроницаемые альгинатные капсулы не позволяют клеткам двигаться наружу и поддерживают их питательными веществами в процессе агрегации.Введенный осадок инкубировали в течение семи дней с использованием той же среды для культивирования клеток, которую меняли каждые два дня. Затем альгинат растворяли в 1% растворе цитрата натрия в dH ₂ O (Sigma Aldrich, США) в течение пяти минут, оставляя нити чистой клеточной ткани с приемлемой когезией, которые можно было обработать для переноса. Поскольку расширение хондроцитов до больших количеств может вызвать потерю хондрогенного фенотипа собранных клеток, мы дополнительно культивировали нити ткани в хондрогенных условиях, чтобы сохранить их фенотип.

Анализ жизнеспособности клеток

Анализ жизнеспособности клеток проводили путем окрашивания живых / мертвых клеток в соответствии с инструкциями производителя. Использовали клеточный ацетоксиметиловый эфир кальцеина (кальцеин AM) и гомодимер этидия-2 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) в концентрации 1,0 мМ каждый. Кальцеин AM маркирует живые клетки ярко-зеленой флуоресцентной меткой. Гомодимер этидия представляет собой красный флуорофор, который окрашивает нежизнеспособные клетки, но не может проникать в живые клетки. Перед окрашиванием каждый образец промывали HBSS.После 30 минут инкубации образцы визуализировали с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа (LSCM) Olympus FluoViewTM FV1000 (Olympus NDT Inc., MA). Проекции оси Z были собраны из изображений каждого образца от поверхности до дна с глубиной 1000 мкм с интервалами 20 мкм. Программное обеспечение ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD) использовалось для автоматической количественной оценки интенсивности окрашенных в красный и зеленый цвета нитей ткани.

Испытание на одноосное растяжение нитей ткани

Нити хрящевой ткани, культивированные в хондрогенных условиях в различные моменты времени (1 нед., 2 нед., 3 нед.) После высвобождения из капсул, использовали для оценки механических свойств.Машина для испытаний на растяжение (MTS Systems Corporation, Eden Prairie, MN) использовалась для проведения испытаний на одноосное растяжение всех образцов (дополнительный рис. 6a). Вкратце, нити ткани фиксировались на специальных захватах на обоих концах и жестко удерживались датчиком нагрузки 5N и платформой на машине. Нити ткани нагружали вручную до достижения положительного натяжения, и в этот момент с помощью цифрового штангенциркуля измеряли диаметр образца и исходную длину. После этого к тканевым прядям прикладывались растягивающие нагрузки при 0.Скорость нагружения 1 мм / с до их разрушения. Были записаны растягивающее напряжение и деформация, а также предельная деформация при растяжении. Модуль Юнга рассчитывали на основе наклона кривой напряжения / деформации. Каждую группу тестировали на 3–4 образцах, и оптимальные механические свойства определялись в зависимости от времени культивирования. Для исследования биопечати использовали тканевые нити с соответствующими механическими свойствами.

Гистологический и иммуногистохимический анализ

Культивированные образцы фиксировали в 4% параформальдегиде, замораживали и делали срезы перед гистологической оценкой.Срезы подвергали окрашиванию гематоксилином и сафранином O-fast зеленым согласно стандартным протоколам ²⁹ . Для иммуногистохимического анализа срезы размером 10 мкм инкубировали в течение 30 минут в блокирующем растворе для предотвращения неспецифического связывания, а затем инкубировали с первичными антителами в течение ночи при комнатной температуре. В этом исследовании использовали кроличьи поликлональные антитела против коллагена типа II и аггрекана (банк гибридных исследований развития, Айова-Сити, Айова). Вторичное козье антимышиное антитело (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA). Продукты реакции визуализировали с помощью наборов Vectastain ABC и DAM Peroxidase Substrate Kit (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA) в соответствии с инструкциями производителей. Все отрицательные контроли были сделаны с использованием одного и того же окрашивания без использования первичных антител. Наблюдение проводилось с помощью микроскопа Olympus BX60 (Olympus NDT Inc. Center Valley, PA).

Анализ DMMB для оценки содержания sGAG

Содержание sGAG определяли с помощью анализа связывания красителя 1,9-диметилметиленового синего (DMMB).Вкратце, были приготовлены серийно разведенные образцы и добавлен раствор DMMB. Поглощение измеряли при 530 нм с использованием микропланшетного ридера VMax Kinetic ELISA (Molecular Devices, Inc., Саннивейл, Калифорния). Содержание sGAG было нормализовано к содержанию ДНК в каждом образце и представлено как sGAG на клетку. Также была проведена количественная оценка ДНК. Вкратце, двухнедельные культивированные тканевые нити, а также нативный суставной хрящ переваривали в папаиновом буфере и затем подвергали количественному анализу ДНК.Набор для анализа дцДНК Quant-iT ^TM PicoGreen (Molecular Probes Inc., Юджин, Орегон) использовали в соответствии с инструкциями производителя. Интенсивность флуоресценции определяли с помощью считывающего устройства для микропланшетов SpectraMax multidetection (Molecular Devices, Inc., Саннивейл, Калифорния), используя длину волны 480 нм (возбуждение) и 520 нм (излучение). Содержание сГАГ в каждом образце нормализовали по содержанию дцДНК.

Экстракция общей РНК, обратная транскрипция и анализ ПЦР в реальном времени

Для проверки уровней экспрессии генов, специфичных для хрящевой ткани, тканевые нити гомогенизировали в реагенте TRIzol (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния), а общую РНК экстрагировали с использованием RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Valencia, CA) в соответствии с инструкциями производителя.кДНК подвергали обратной транскрипции с использованием наборов для обратной транскрипции TaqMan Micro RNA (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния) в соответствии с инструкциями производителя. Набор SYBR Green для ПЦР в реальном времени (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния) был использован для анализа уровней транскрипции генов, связанных с хрящевым матриксом, включая коллаген типа II, аггрекан и хондрогенный фактор транскрипции Sox9. Читателя отсылают к дополнительным методам S5 для получения подробной информации о ПЦР в реальном времени.

Самосборка тканевых нитей

Эксперименты по слиянию были проведены для проверки способности тканевых нитей самособираться в более крупные ткани.Вкратце, несколько индивидуальных конструкций помещали на чашку Петри диаметром 150 мм близко друг к другу при контакте. Добавляли минимальное количество питательной среды, чтобы клетки выжили без потери контакта. Микроскопические изображения (Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, IL) были сделаны в разные моменты времени, чтобы контролировать процесс слияния с минимальными нарушениями. Для получения изображений с флуоресцентной микроскопии клетки перед визуализацией окрашивали кальцеином AM (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния).

Трехмерная биопечать нитей ткани

Чтобы проверить потенциал использования нитей ткани в качестве «биочернилы» для изготовления более крупных участков ткани, мы провели эксперименты по непосредственной биопечати нитям хрящевой ткани в определенные формы, которые позже созрели in vitro в интегрированный хрящ. ткань.Для биопечати нитей ткани мы разработали и настроили систему сопел и изготовили ее с помощью 3D-печати, как описано в дополнительных методах S4. Перед биопечатью нити ткани загружали в складную насадку в стерильных условиях, как показано в дополнительном видео 1. Нити ткани переносили в насадку внутри их капсул и помещали в полость насадки. Затем к капсуле добавляли 4% раствор цитрата натрия для удаления поперечных связей с последующим удалением зажимов сосуда.Затем избыточное количество раствора цитрата натрия аспирировали, оставляя некоторое количество для сохранения гидратации тканевой нити. Для более длинных нитей добавляли капли клеточной среды, чтобы предотвратить обезвоживание, поскольку биопечать более длинных нитей занимало больше времени. Наконец, на МАБП было установлено складное сопло. Нам удалось биопечать тканевые нити как на предметных стеклах (см. Дополнительное видео 2), так и на фильтровальной бумаге в чашке. Перед биопечатью на фильтровальной бумаге мы увлажняли фильтровальную бумагу каплями среды, чтобы сохранить поверхность и нити ткани, отпечатанные биопечатью, гидратированными.Использовали скорость печати робота 100 мм / мин и скорость экструзии 50,8 мм / мин. Во время или после биопечати не использовался поддерживающий материал, и нити ткани в достаточной степени приклеивались к поверхности фильтровальной бумаги, предотвращая соскальзывание во время биопечати. Добавляли дополнительные капли среды, чтобы они оставались гидратированными в течение нескольких часов, пока не была достигнута достаточная целостность ткани. Позже образцы были перенесены в чашку для культивирования тканей для инкубации.

Биомеханическая оценка качества регенерированной хрящевой ткани

Чтобы дополнительно охарактеризовать механические свойства регенерированной хрящевой ткани, мы выполнили компрессионные тесты на отпечатанных участках ткани с использованием машины для тестирования материалов MTS Insight (MTS Systems Corporation, Eden Prairie, MN) ( Дополнительный рис.7б). Вкратце, толщину отпечатанной ткани измеряли с помощью лазерной измерительной системы (Keyence Corporation of America, Итаска, Иллинойс). Непористый валик приводили в контакт с поверхностью ткани, и ткань сжимали до 20% деформации при 2 мм / с (ходьба человека) с нагрузкой 10 Н, удерживаемой в течение 5 минут. Модуль Юнга был рассчитан во время начального периода нагружения (от 15% до 20% деформации). Образцы нативного хряща собирали из блоковой бороздки мыщелков бедренной кости крупного рогатого скота и использовали в качестве контроля.

Имплантация пластырей хряща с биопечатью

Чтобы проверить потенциал биопечати хряща для восстановления повреждений суставного хряща, было проведено исследование имплантации ткани на модели дефекта хряща крупного рогатого скота in vitro . Вкратце, костно-хрящевые эксплантаты (диаметром 12 мм и толщиной 8–10 мм) были взяты из бороздок головок мыщелков бедренной кости крупного рогатого скота (возраст 12–18 месяцев, всего 8 животных) с помощью специального сверла. Все эксплантаты культивировали в среде DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (Invitrogen Life Technologies, Карлсбад, Калифорния), 50 мкг / мл L-аскорбиновой кислоты, 100 Ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 2.5 мкг / мл фунгизона. После двух дней предварительного равновесного культивирования были созданы квадратные хондральные дефекты полной толщины (2 мм) (4 мм × 4 мм), как описано ранее ³⁰ . Затем отпечатанная хрящевая ткань имплантировалась в дефект путем запрессовки. После имплантации ткани эксплантаты снова помещали в культуру в хондрогенной среде (DMEM, содержащая 10 нг / мл TGF-β1, 100 нг / мл IGF-1, 0,1 мкМ дексаметазона, 25 мкг / мл L-аскорбата, 100 мкг / мл пирувата, 50 мг / мл ITS + Premix) при 5% CO ₂ , 37 ° C в течение до четырех недель.Гистологию и иммуногистохимию использовали для оценки экспрессии хрящевых маркеров и образования ECM.

Статистический анализ

Все данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение и были проанализированы с помощью GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, La Jolla, CA) с использованием t-критерия Стьюдента. Различия считались достоверными при p <0,05 (*) и p <0,01 (**). NS означает «не имеет значения». Процент жизнеспособных клеток для каждой экспериментальной группы был рассчитан путем усреднения значений трех разных местоположений из трех разных образцов.

Модель удаления агрегации для образования и определения размера постсинаптических каркасных доменов

Abstract

Формирование и стабильность синапсов — ключевые вопросы нейробиологии. Классически постсинаптические домены считались результатом локальной вставки и оборота белков в синапсе. Однако вставка, вероятно, будет происходить вне постсинаптических доменов, и достижения в области визуализации одиночных молекул показали, что белки диффундируют в плоскости мембраны до их накопления в синапсах.Мы количественно исследовали этот сценарий с помощью компьютерного моделирования и математического анализа, взяв для определенности конкретный случай ингибирующих компонентов синапсов, то есть рецептора глицина (GlyR) и связанного с ним каркасного белка гефирина. Наблюдаемые размеры доменов кластеров каркаса можно объяснить динамическим балансом между агрегацией белков гефирина, диффундирующих, пока они связаны с GlyR, и их оборотом на мембране нейрона. Мы также предсказываем существование внесинаптических кластеров с характерным распределением размеров, которые вносят значительный вклад в колебания размеров синаптических доменов.Новые данные сверхвысокого разрешения для белков гефирина установили существование внесинаптических кластеров, размеры которых согласуются с предсказаниями модели в ряде параметров модели. На общем уровне наши результаты подчеркивают агрегацию с удалением как неравновесное фазовое разделение, которое приводит к образованию структур регулируемого размера.

Сведения об авторе

Синапсы обеспечивают передачу информации между нейронами и являются физической опорой памяти. Было установлено, что синапсы — это динамические биологические структуры.Рецепторы нейротрансмиттеров диффундируют в мембрану нейрона, а белки синаптического каркаса постоянно обновляются. Мы предлагаем биофизическую модель, которая связывает эти различные измеряемые величины для компонентов тормозных синапсов и показывает, как они определяют размер постсинаптических доменов. Модель предсказывает, что синаптические каркасы также существуют вне синапсов и что они вносят вклад в колебания синаптических размеров. Мы подтверждаем с помощью микроскопии сверхвысокого разрешения существование внесинаптических каркасов.Их распределение по размерам согласуется с предсказаниями модели для конкретных параметров. Модель должна быть полезной для лучшего понимания динамики синапсов и их возможных уровней регуляции.

Образец цитирования: Ранфт Дж., Алмейда Л.Г., Родригес П.С., Триллер А., Хаким В. (2017) Модель удаления агрегации для формирования и определения размера постсинаптических каркасных доменов. PLoS Comput Biol 13 (4):
e1005516.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1005516

Редактор: Франческо П. Батталья,
Radboud Universiteit Nijmegen, НИДЕРЛАНДЫ

Поступила: 07.12.2016; Принята к печати: 11 апреля 2017 г .; Опубликован: 24 апреля 2017 г.

Авторские права: © 2017 Ranft et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в документе и его файлах с вспомогательной информацией.

Финансирование: JR было поддержано исследовательской стипендией Deutsche Forschungsgemeinschaft (RA 2571 / 1-1; http://www.dfg.de). PCR был поддержан Международной стипендией Марии Кюри в рамках 7-й Рамочной программы Европейского сообщества (https://ec.europa.eu/research/fp7/). LGA была поддержана проектом Human Brain Project. Экспериментальная работа была поддержана Национальным агентством исследований (Syntaptune), грантом ERC на продвинутые исследования (PlasltInhib) и программой «Investissements d’Avenir» (ANR-10-LABX-54 MEMO LIFE).Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Синапсы опосредуют передачу информации между нейронами и обычно считаются, по крайней мере частично, поддержкой памяти. Однако при исследовании на молекулярном уровне синапсы выглядят как динамические сборки, компоненты которых обмениваются на временные шкалы от десятков минут до секунд [1].Это поднимает фундаментальные вопросы о способах поддержания памяти [2]. На постсинаптической стороне рецепторы нейротрансмиттеров в основном встроены в плазматическую мембрану нейрона в несинаптических локусах [3–5]. Одночастичные методы визуализации и отслеживания показали, что они впоследствии диффундируют в плазматической мембране в синаптические домены и из них (см. [1] для обзора и ссылок в нем). Постсинаптическая плотность (PSD) содержит каркасные белки, которые обеспечивают сайты связывания для рецепторов и временно стабилизируют их в PSD.Сила синапса определяется количеством рецепторов в PSD в данный момент. Это количество зависит от количества сайтов связывания рецепторов, обеспечиваемых каркасными белками [6], а также от сродства между рецепторами и каркасными белками [7]. Следовательно, размер PSD, то есть количество сайтов связывания каркасного белка, является ключевым фактором, определяющим синаптическую силу.

Мы сосредоточили наше исследование на тормозных синапсах, большинство компонентов которых было идентифицировано и функционально охарактеризовано.Каркасный белок гефирин является центральным структурным компонентом тормозных синапсов [8]. В большинстве случаев каркасные белки, включая гефирин [9, 10], обновляются в синаптическом домене за время от минут до часов (см. Обзор [11]). Основная олигомерная форма полноразмерного гефирина — это тример, опосредованный сильными взаимодействиями N-концевых G-доменов [12–14]. В эукариотических клетках тримеры гефирина в конечном итоге подвергаются дальнейшей олигомеризации [15], которая, как предполагается, лежит в основе постсинаптического кластеризации в нейронах.Гефирин присутствует в клеточной цитоплазме, но он также может диффундировать чуть ниже плазматической мембраны, когда связывается с рецепторами [16].

В PSD, гефириновые белки образуют гомо-мультимерные каркасы непосредственно под плазматической мембраной. В последние годы были собраны точные данные о нескольких биофизических параметрах, управляющих динамикой рецепторов и каркасных белков, как описано в [1]. Были определены константы диффузии и концентрации GlyR внутри и снаружи тормозных синапсов (см. [17] и ссылки в нем).Распределение размеров PSD и гефириновых каркасов также было измерено [6].

Модель синапса, основанная на этих данных и связывающая их, необходима для решения вопросов формирования, поддержания и динамики синапсов с точной биофизической точки зрения. Совместная экспрессия в фибробластах GlyR и гефирина достаточна для генерации на плазматической мембране кластеров размеров, аналогичных размеру PSD в тормозных синапсах [9]. Это открытие послужило мотивацией для теоретического исследования того, как диффузия рецепторов, ассоциация рецепторов с каркасами и самоагрегация каркасных белков могут приводить к образованию доменов заданного размера.Некоторые предыдущие работы начали решать этот вопрос. Были предложены уравнения реакции-диффузии для описанных выше процессов, и авторы предположили, что нестабильность типа Тьюринга может лежать в основе образования синаптических доменов [18, 19]. В другом исследовании были описаны только рецепторы, и в качестве альтернативы было предложено, что кластеры синаптических рецепторов могут быть результатом динамического баланса между входящим потоком диффундирующих рецепторов и оттоком из кластера в цитоплазму клетки, опосредованного удалением рецептора [20].То, что диффузия, агрегация и удаление молекулярных компонентов могут служить для образования макромолекулярных доменов в мембране, было ранее предложено для образования и поддержания липидных рафтов и точно исследовано в этом контексте [21, 22]. Сходные механизмы, как было показано, контролируют организацию или кластеры E-cadherin на клеточных мембранах [23]. Ясно, что время жизни кластера белков может быть на много порядков больше, чем время жизни его составляющих, что является привлекательной особенностью для структуры хранения в памяти [2], которая ранее была теоретически исследована [24].

Основываясь на этих предыдущих работах, мы теперь исследовали характеристики каркасных доменов, продуцируемых каркасными белками (здесь гефирином), связанными с рецепторами (здесь GlyR), диффундирующими в плазматическую мембрану. Принимая во внимание доступные биофизические данные [6, 9, 16], мы сначала делаем вывод, что комбинированный эффект агрегации, диффузии и удаления дает типичные размеры доменов каркаса, которые аналогичны наблюдаемым экспериментально. Затем компьютерное моделирование на основе частиц и теоретический анализ позволяют всесторонне охарактеризовать размеры и динамику кластеров в результате этих основных процессов.В согласии с предыдущими работами по агрегации и удалению в других контекстах [25, 26], мы показываем, что агрегация и удаление каркасных белков обеспечивает неравновесный процесс, лежащий в основе распределения динамически развивающихся каркасных доменов разного размера. Кроме того, мы предсказываем, как распределение размеров этих доменов зависит от биофизических параметров, таких как время оборота каркасных белков на плазматической мембране и зависимость диффузии кластеров от размера.

Фактическое распределение кластеров гефирина по размерам было измерено в культивируемых нейронах спинного мозга с помощью микроскопии сверхвысокого разрешения.Сравнивая эти новые наблюдения с модельными прогнозами, мы затем делаем вывод о биофизических параметрах, которые управляют сборкой гефириновых доменов в соответствии с предложенной моделью агрегации, диффузии и обмена белков.

Результаты

Баланс между латеральной агрегацией и цитоплазматической рециркуляцией белков каркаса устанавливает размер домена каркаса

Мы решили оценить совместную роль

1. латеральная диффузия связанных комплексов каркас-рецептор в мембране,
2. агрегация белков каркаса и
3. Удаление белка каркаса на мембране и в каркасах

, сначала проанализировав сокращенную модель динамики белка каркаса на мембране, см. Рис. 1.В этой модели единственный каркасный домен окружен диффундирующими «частицами» каркаса (т. Е. Тримерами гефирина), связанными с рецепторами. Край домена действует как поглощающая граница на диффундирующих комплексах, тем самым создавая градиент концентрации, который, в свою очередь, вызывает входящий диффузионный поток белков каркаса.

Рис. 1. Боковая диффузия и агрегация комплексов каркас-рецептор на постсинаптической мембране.

A: Схема основных процессов модели: рецепторы (GlyR, синий) и «частицы» каркаса (тримеры гефирина, зеленый) могут образовывать комплексы; частицы каркаса доставляются к клеточной мембране с потоком J и покидают ее со скоростью k ; субмембранные частицы каркаса агрегируются посредством гомотипических взаимодействий белков каркаса; Комплексы каркас-рецептор диффундируют латерально вдоль клеточной мембраны с константой диффузии D .B: Профиль концентрации диффундирующих частиц каркаса вокруг дискообразной области каркаса радиусом R . Вдали от кластера концентрация диффундирующих частиц каркаса однородна и равна Дж / k . Распространяющиеся частицы каркаса обеднены слоем размером, близким к границе кластера. C: Зависимость размера стационарного домена N от концентрации частиц c ₀ . D: Зависимость N от скорости оборота k .Базовые параметры приняты равными D = 0,02 мкм м ² / с [16], k = 1 / (30 мин) [9], c ₀ = 4/3 мкм м ⁻² [16, 27]. Концентрация каркасных частиц / тримеров в постсинаптическом домене принята равной ρ = 5000/3 μ m ⁻² [6]. Когда параметры изменяются в B и C, контрольные значения отмечаются (красный лозунг).

https://doi.org/10.1371 / journal.pcbi.1005516.g001

Поскольку этот приток растет максимально по периметру домена, в то время как отток белка из-за десорбции агрегированных белков каркаса в цитоплазму масштабируется с площадью домена, баланс обоих потоки возникают для четко определенного размера домена. Результирующий равновесный размер может быть рассчитан аналитически (см. S1 Text: Single scaffold domain) и зависит от биофизических параметров, таких как коэффициент диффузии комплексов каркас-рецептор во внесинаптической мембране D ₀ , скорость удаления белков каркаса k , общая поверхностная концентрация белков каркаса на мембране c ₀ и плотность белков каркаса в домене ρ .Обратите внимание, что k — это эффективная скорость, которая фиксирует любой локальный дисбаланс связывания и отсоединения каркасных частиц от и внутрь цитоплазмы, соответственно. Измеренное в количестве N частиц каркаса, его «строительных блоков», выражение для размера домена выглядит следующим образом:
(1)
(Явный вид функции Φ ( x ) дается уравнением (S5, S7) в тексте S1: единый каркасный домен.) На рис. 1C и 1D размер домена N показан как функция от c ₀ и k соответственно.

Чтобы проверить правдоподобность образования и обслуживания каркаса путем диффузии и удаления, мы рассчитываем ожидаемый размер домена, используя приведенное выше уравнение и оценки параметров для гефирина и GlyR из литературы, см. Рис. 1. Предполагая, что наименьшая встречающаяся единица гефирина или «строение block »представляют собой тримеры гефирина [12–14], мы получаем приблизительный размер домена N, ≃ 70 тримеров или 210 мономеров гефирина, что удивительно близко к ранее опубликованным измерениям размеров доменов гефирина [6].Таким образом, мы заключаем, что диффузия, агрегация и оборот действительно могут быть ключевыми механизмами, участвующими в установлении размера синаптических каркасных доменов.

Приведенный выше анализ явно связывает размер постсинаптических гефириновых доменов с измеренной константой диффузии GlyRs и скоростью оборота гефирина в каркасных доменах. Однако он основан на простом предположении об одном кольцевом домене гефирина, окруженном диффундирующими комплексами тримера GlyR-гефирина. Для дальнейшего исследования предложенного сценария формирования постсинаптического каркасного домена мы приступаем к изучению более подробной, действительно основанной на частицах модели агрегации каркаса с помощью компьютерного моделирования.Это позволяет нам проверить влияние упрощающих предположений, таких как предполагаемая округлость доменов каркаса, и рассмотреть возможность множественных диффузионных доменов каркаса различных размеров. Самое интересное, что это позволяет нам получать прогнозы от модели о распределении размеров каркасных доменов, которые мы затем сравниваем с новыми данными.

Модель на основе частиц динамики каркасного белка на мембране

В моделировании на основе частиц мы рассматриваем отдельные частицы каркаса, прикрепленные к мембране, которые диффундируют латерально на мембране.Частицы связываются друг с другом при встрече во время их случайных диффузионных траекторий, имитируя гомотипические взаимодействия белков каркаса.

Поскольку детали агрегации каркаса, диффузии и динамики предметной области еще предстоит описать, мы решили сделать простые предположения, чтобы получить вычислительно эффективную модель с несколькими параметрами, как подробно описано ниже (см. Также Материалы и методы для деталей нашей реализации). .

Частицы собираются при встрече и образуют кластеры.Мы предполагаем, что частицы в кластере перестраиваются в круговую дискообразную форму домена. (Чтобы проверить влияние этого предположения, мы также выполнили несколько симуляций, где, напротив, не допускались никакие перегруппировки, как описано ниже.)

Дискообразные скопления могут сами диффундировать и агрегироваться. Таким образом, нам необходимо предписать возможную зависимость постоянной диффузии от размера. Теория Саффмана-Дельбрюка [28] для термодиффузии предсказывала бы логарифмическую размерную зависимость константы диффузии, возникающую из-за гидродинамических эффектов (см., Однако, [29] для белков, размер которых сравним с толщиной мембраны).Этот классический результат может быть изменен возможными взаимодействиями каркасных белков с корой клеток, нетепловыми эффектами, а также более сложной природой опосредованной рецепторами диффузии каркасных доменов. Для простоты и во избежание введения характерного размера «ad hoc» мы рассматриваем степенную зависимость размера
(2)
где D ( n ) — константа диффузии кластеров, содержащих n каркасных частиц, а σ — показатель зависимости от размера ( σ = 0, когда применяется результат Саффмана-Дельбрюка [28]).В нашей модели σ является дополнительным параметром системы в дополнение к тем, которые были введены ранее.

Предполагается, что частицы десорбируются в цитоплазму с эффективной скоростью k , моделируется стохастическим удалением отдельных частиц с мембраны. Мы предполагаем постоянную скорость k , независимо от размера области, к которой принадлежат частицы. Как показано ниже, этого предположения достаточно, чтобы учесть имеющиеся данные. Мы также пренебрегли латеральной десорбцией частиц в мембране после агрегации, поскольку сродство связывания между тримерами гефирина высокое.Это равносильно предположению, что концентрация диффундирующих частиц гефирина в мембране велика по сравнению с концентрацией в равновесии с конденсированной фазой каркаса (т.е. мы пренебрегаем «давлением паров» гефирина). Существование значительной латеральной десорбции фактически привело бы к уменьшению входящего потока частиц на каждый кластер и к занижению нашей нынешней подобранной константы диффузии. Боковая десорбция также будет способствовать более компактным агрегатам [30] (см. Также Обсуждение) в случае динамики частичной перегруппировки.

Десорбция частиц уравновешивается поступающим потоком Дж отдельных частиц к мембране, что обеспечивает постоянство средней общей концентрации частиц, прикрепленных к мембране c ₀ = Дж / k .

Внесинаптическая агрегация синаптических белков

Типичный снимок нашего моделирования показан на рис. 2A. Выйдя за рамки упрощенного предположения об одном недиффузирующем домене каркаса, мы, в частности, обнаруживаем в наших симуляциях непрерывную генерацию небольших кластеров на мембране.Эти кластеры продолжают диффундировать, хотя и медленнее из-за их увеличенного размера, что приводит к ансамблю кластеров всех размеров (Рис. 2A – 2C). В конце концов, рост конкретного кластера ограничен оборотом составляющих его каркасных частиц, аналогично приведенной модели единственного домена, обсужденной выше.

Рис. 2. Моделирование образования каркасных доменов.

Если не указано иное, значения параметров моделирования равны k = 2,0 ⋅ 10 ⁻⁵ D ₀ ρ , c ₀ = 0.9 10 ⁻³ ρ , где ρ = 0,77 a ⁻² и a — диаметр основных частиц, а показатель диффузии (уравнение (2)) равен σ = 0,5. A: Снимок динамики домена каркаса. Шкала 100 a ; отдельные кластеры увеличены в 3 раза для лучшей визуализации. B: Характерное распределение наблюдаемых размеров кластера не зависит от деталей внутренней структуры кластера. Распределение кластеров по размерам показано для моделирования на панели A (черные кружки) с идеальной перестройкой частиц, т.е.е. дискообразные кластеры и для моделирования без перегруппировки частиц, но с идентичными параметрами (красные точки; снимок моделирования и типичный кластер показаны на вставке). Обратите внимание, что плотность фрактальных кластеров непостоянна и зависит от размера кластера; для сравнения используется плотность ρ = 0,77 a ⁻² дискообразных кластеров. Вставка масштабной линейки 50 a . C: Характерные распределения размеров кластеров при моделировании с разными показателями диффузии σ , но в остальном идентичными параметрами (закрашенные кружки).Данные для σ = 0,5 соответствуют моделированию, показанному на A. На результаты моделирования накладываются теоретические кривые, полученные из уравнений скорости (сплошные линии), подробности см. В тексте. D: Масштабирование типичного размера кластера 〈〈 n 〉〉 с c ₀ D ₀ / k для различных σ и c ₀ . Сплошная черная линия: 〈〈 n 〉〉 ∝ c ₀ D ₀ / k ; пунктирная черная линия: 〈〈 n 〉〉 ∝ ( c ₀ D ₀ / k ) ^1/2 .

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1005516.g002

В качестве довольно общего результата мы обнаруживаем, что кластеры становятся все реже с увеличением размера (рис. 2B и 2C). Распределение кластеров по размерам для показателя постоянной диффузии σ = 0,5 показано на фиг. 2B как при полной перегруппировке агрегирующих частиц в кольцевые домены, так и, наоборот, когда перегруппировка не выполняется после агрегации. В то время как перегруппировка после кластеризации имеет большое влияние на форму домена (см. Вставку на рис. 2B), ее влияние на распределение размера кластера незначительно.Это справедливо и для других показателей постоянной диффузии. Поскольку здесь мы не сосредотачиваемся на формах каркасных доменов, для вычислительной эффективности мы рассматриваем далее только полностью перестроенные кластеры.

Форма распределения кластеров по размерам определяется размерной зависимостью константы диффузии кластеров (рис. 2C). Качественно, когда σ увеличивается от нуля (т.е. диффузия больших кластеров все больше подавляется), предел больших размеров распределения уменьшается, что подразумевает меньший диапазон размеров кластеров.Кластеры также более равномерно распределены по доступному диапазону размеров.

Распределения кластеров по размерам, полученные при моделировании частиц, количественно сравниваются на рис. 2C с численными решениями скоростных уравнений Смолуховского [25, 26, 31, 32] (см. S1 Text: Rate Equations). Эти уравнения довольно точно учитывают полученные распределения после подбора одного общего кинетического параметра (см. S1 Text: Rate Equations и S1 Fig). Для постоянной диффузии, не зависящей от размера, можно аналитически показать, что распределение является степенным с показателем -3/2 и экспоненциальным отсечением (уравнение.S14 в S1 Text: Rate Equations). В общем случае σ ≠ 0 скоростные уравнения по-прежнему позволяют численно определить стационарное решение для распределения кластеров по размерам (см. Также S1 рис.). Когда σ > 0, диффузия постепенно замедляется для все больших и больших кластеров. Эта уменьшенная диффузия ограничивает рост больших кластеров по сравнению с меньшими кластерами, и распределение смещается в сторону меньших размеров с увеличением σ . Форма постепенно отклоняется от степенного закона, наблюдаемого для σ = 0, что в конечном итоге приводит к появлению плеча при меньшем размере отсечки, за пределами которого кластеры снова становятся экспоненциально редкими.

Кластеры большего размера встречаются реже, чем кластеры меньшего размера, но поскольку они содержат больше частиц каркаса, большинство частиц каркаса все же можно найти в кластерах большого размера. Полезной величиной для характеристики таких распределений является «типичный» размер кластера, который соответствует среднему размеру кластера, когда кластеры взвешиваются по количеству содержащихся в них частиц. Он определяется как 〈( n 〉〉 ∑ _n n ² c _n / ∑ _n nc12 _{c n — концентрация кластеров размером n .}

Типичный размер кластера как функция биофизических параметров диффузии и оборота показан на рис. 2D. Мы обнаружили, что для данного показателя зависимости постоянной диффузии от размера σ , типичный размер существенно зависит от безразмерной комбинации параметров c ₀ D ₀ / k в соответствии с
(3)
Для постоянной поверхностной концентрации частиц каркаса c ₀ и заданного σ типичный размер кластера увеличивается с общей постоянной диффузии D ₀ и уменьшается с более высокой эффективной скоростью оборота k .(Обратите внимание, что при постоянном потоке цитоплазматических частиц Дж на мембрану изменение k также изменяет общую поверхностную концентрацию через c ₀ = Дж / k .) В противоположном случае при изменении c ₀ при сохранении продукта c ₀ D ₀ / k постоянным, типичный размер кластера остается примерно постоянным; соответственно, масштабирование 〈〈 n 〉〉 с c ₀ D ₀ / k не зависит от конкретного значения c ₀ , для которого было выполнено моделирование.

В принципе, масштабный показатель α зависит от точной формы распределения кластеров по размерам, но простой масштабный аргумент рационализирует наблюдаемое соотношение (уравнение 3). Предполагая, что большинство частиц каркаса агрегировано в кластеры размером N , концентрация этих кластеров определяется выражением c _N ≃ c ₀ / N . Таким образом, среднее расстояние между кластерами масштабируется как.Константа диффузии кластеров определяется как D _N = D ₀ N ^{— σ} , временная шкала их диффузионного сближения масштабируется как T ∝ L L . 2 / D _N ≃ N ^{1+ σ} / ( c ₀ D ₀ ). Чтобы N был стабильным размером кластера, эта шкала времени должна соответствовать типичному времени оборота 1/ k , в противном случае кластеры либо растают, либо вырастут в размерах.Тогда сразу получается N ∝ ( c ₀ D ₀ / k ) ^{1 / (1+ σ )} .

Распределение кластеров гефирина по размерам

Наше моделирование предсказывает, что размеры каркасных доменов зависят от непрерывной агрегации каркасных белков в кластеры на мембране, которые, в свою очередь, обеспечивают образование более крупных доменов. Поскольку ожидаемое распределение размеров кластеров определяется биофизическими параметрами диффузии и оборота, эти параметры в принципе могут быть выведены из наблюдаемых распределений размеров кластеров каркаса.Таким образом, мы экспериментально определили распределение размеров гефириновых каркасов в нейрональной мембране культивируемых нейронов спинного мозга, как для подтверждения предыдущих выводов о существовании внесинаптических кластеров, так и для измерения соответствующих параметров D ₀ / k , c ₀ и σ . С этой целью микроскопия сверхвысокого разрешения на фиксированных нейронах использовалась для подсчета количества отдельных белков гефирина в кластерах (см. Ранее опубликованные материалы и методы [6]).Вкратце, флуоресцентно меченые белки гефирина стохастически активируются при низкой интенсивности света, так что вероятность одновременной активации близлежащих белков исчезающе мала. Таким образом, пространственно разделенные световые всплески активированных белков могут быть локализованы с точностью до субволновой длины. Поскольку каждый меченый белок активируется один раз перед тем, как попасть в «темное» состояние, вся популяция белка может быть отображена в ходе эксперимента, а кластеры реконструированы по зарегистрированным положениям частиц, см. Рис. 3A – 3C.

Рис. 3. Кластеры гефирина и сравнение с модельными распределениями.

A: Обычная флуоресцентная микроскопия нейронов спинного мозга, экспрессирующих белок mEos2-гефирин. Масштабная линейка 5 мкм м. B: визуализированное PALM-изображение со сверхвысоким разрешением того же сегмента, показанного на A, получено более 20 тыс. Кадров с частотой кадров 20 мс. C: представление точки B в виде пуантилистов, где каждая точка представляет собой одно обнаружение. D: Максимальное правдоподобие экспериментально определенных распределений для данных параметров k и σ , с оптимальным c ₀ , варьирующимся индивидуально для каждой культуры (материалы и методы).Выделенная область параметров (оранжевый) соответствует 95% вероятности для N = 10000 повторных подгонок случайных выборок начальной загрузки из экспериментальных распределений. Серая заштрихованная область соответствует экспериментально вероятному диапазону k / D ₀ = 1,4 · 10 ⁻² — 4,2 · 10 ⁻¹ μ м ⁻² . E: Экспериментально определенное распределение размеров кластеров гефирина и подобранные распределения для всех трех культур.Экспериментальные концентрации были безразмерны с использованием тримеров = 5000/3 мк м ^-2 .

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1005516.g003

Количество обнаружений напрямую связано с размером кластера гефирина [6]. Мы находим кластеры гефирина всех размеров, вплоть до кластеров из 71 тримеров (см. Рис. 3E, рис. S2). Самые большие домены, вероятно, будут постсинаптическими, 89% из которых обнаружены прикрепленными к синаптическим терминалам в предыдущей работе [33].Меньшие кластеры гефирина должны соответствовать внесинаптическим кластерам, что согласуется с так называемыми нанокластерами, ранее визуализированными вне синапсов с помощью микроскопии сверхвысокого разрешения [6].

Существование кластеров разного размера соответствовало нашим предсказаниям. Поэтому мы сравнили экспериментально измеренные распределения с распределениями, созданными нашей моделью для различных комбинаций параметров. Вычисляя вероятность данных для заданных теоретических распределений, мы определили параметры, которые лучше всего объясняют наши данные и которые мы называем максимально вероятным соответствием нашей модели.Комбинируя этот анализ для всех культур ( n = 3), позволяя общей концентрации каркаса, c ₀ , варьироваться между культурами, мы получаем глобальную оценку показателя диффузии, σ = 0,5, и отношения постоянной диффузии по скорости оборота частиц, D ₀ / k = 30 μ m ² , см. рис. 3D. Общая концентрация каркаса варьируется между культурами от c ₀ = 0.5-5 мкм м ^-2 , см. Рис. 3E.

Кластерная динамика и флуктуации размеров каркасных доменов

Наше моделирование позволяет нам учитывать временные колебания размеров кластеров каркаса и их стабильность во времени. Траектория размера отдельного кластера показана на рис. 4А. Он колеблется около четко определенного среднего размера, чередуясь между стохастическим увеличением из-за слияния с другими кластерами и относительно плавным уменьшением в характерном временном масштабе τ _fluc из-за непрерывной потери частиц в цитоплазму.Такое поведение типично для всех отслеживаемых кластеров. В частности, кластеры с небольшими начальными размерами растут путем слияния с другими кластерами и колеблются около среднего размера после нескольких τ _fluc (рис. 4A, голубые линии). Это приводит к тому, что распределение размеров, исследуемое кластером во времени, показанное на рис. 4B, отличается от мгновенного распределения всех кластеров на мембране в данный момент времени (рис. 3E) с подавлением малых размеров кластера. Автокорреляция размера кластера C ₂ ( τ ) = 〈 n ( t + τ ) n ( t )〉 — 〈 n 〉 ^{2 динамики флуктуаций около среднего размера кластера.Он показан на рис. 4C как для моделирования на основе частиц, так и для моделируемых траекторий на основе подхода основного уравнения (см. S1 Text: Rate Equations). Упрощенное описание последнего подхода обеспечивает явное выражение для C ₂ ( τ ) и предсказывает, что τ _fluc задается скоростью оборота каркасного белка, τ _fluc ≃ 1 / k (см. S1 Text: Rate Equations) в хорошем количественном согласии с результатами моделирования.}

Рис. 4. Прогнозируемое изменение размера отдельных кластеров.

A: эволюция среднего размера кластера (среднее ± стандартное отклонение) для кластеров начального размера из 2 (светло-голубых) и 100 (светло-красных) частиц, соответственно, усредненных по независимым смоделированным траекториям размера кластера ( n ₂ = 50 ⋅ 10 ⁶ , n ₁₀₀ = 4000), взятых из моделирования. Также показана типичная траектория размера кластера (темная сплошная линия). Параметры моделирования идентичны рис. 2А.B: Распределение размеров кластера на долгое время. Большие кластеры сохраняются в течение длительного времени и исследуют распределение по размерам, показанное здесь, благодаря добавлению частиц путем слияния с другими кластерами и удалению частиц путем десорбции. Распределение, полученное по смоделированным траекториям ( n = 1000) с использованием подхода основного уравнения (MEQ) (серая сплошная линия, подробности см. В тексте), немного отличается, поскольку пространственные корреляции игнорируются. C: Автокорреляция, C ₂ ( τ ) = 〈 n ( t + τ ) n ( t )〉 — 〈 n 〉 ² , из размер кластера n ( t ), полученный из моделирования полной частицы (черная сплошная линия) и из метода MEQ (сплошная серая линия).Также показан аналитический прогноз экспоненциального затухания с характерной скоростью k (пунктирная серая линия). D: Функция Y ( τ ) = 〈 n ( t + τ ) n ( t ) ² 〉 — 〈 n ( t + τ ) ² n ( t )〉 (сплошная черная линия). Тот факт, что Y ( τ ) не равно нулю, означает, что динамика не инвариантна относительно обращения времени и, следовательно, находится вне термодинамического равновесия.Также показано приближение Y ( τ ) ∝ exp (- kτ ) [1 — exp (- kτ )] (серая пунктирная линия), а также функция Y ( τ ) генерируется методом MEQ (сплошная серая линия) (подробности см. в тексте и тексте S1: уравнения скорости).

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1005516.g004

Изменение размера кластера во времени, показанное на рис. 4A, явно не инвариантно при обращении времени. Интересно отметить, что это прямой признак того, что рассматриваемый процесс находится вне термодинамического равновесия, поскольку флуктуации термодинамического равновесия не должны позволять определять стрелу времени.Одна количественная мера неравновесного характера лежащей в основе динамики обеспечивается третьим моментом Y ( τ ) = 〈 n ( t + τ ) n ( t ) ² 〉 — 〈 n ( t + τ ) ² n ( t )〉 [34, 35], которое по построению исчезает для систем, инвариантных относительно обращения времени. Нетривиальная функция Y ( τ ), полученная из временных траекторий размера кластера, показана на рис. 4D вместе с приближениями, основанными на подходе основного уравнения (см. S1 Text: Rate Equations).

Обсуждение

Мы предлагаем модель формирования и обслуживания каркасных доменов. Он основан на

1. доставка каркасных белков на плазматическую мембрану,
2. рецептор-опосредованная диффузия каркаса на плазматической мембране и
3. рост скаффолда при встрече и мультимеризация с другими скаффолдами.

Уравновешивание этого процесса роста кластеров путем непрерывного удаления каркасных белков приводит к стабилизации максимального размера домена, а также к стационарному распределению кластеров каркаса разного размера.В предыдущей работе [6] было показано, что популяция небольших внесинаптических кластеров сосуществует с большими синаптическими кластерами, но размеры первых точно не были определены количественно. Мы здесь предоставили новые данные микроскопии сверхвысокого разрешения, которые показывают, что постсинаптические кластеры принимают непрерывный диапазон размеров от тримеров гефирина до размеров, характерных для синаптических доменов. Это согласуется с характерной характеристикой динамики агрегации-удаления, которая лежит в основе их образования.Сравнение экспериментальных данных с модельными распределениями по размерам позволило уточнить биофизические параметры этой динамики. Более того, мы обнаружили, что существование диффундирующих внесинаптических кластеров имеет важные последствия для флуктуаций размера синаптических доменов, поскольку первые могут сливаться со вторыми. Наше моделирование было сосредоточено на динамике этих внесинаптических кластеров. Когда один из них отслеживается с течением времени, он достигает на шкале времени в час большого размера области распределения размеров домена и колеблется вокруг него, как показано на рис. 4A.В простейшем представлении синаптические домены являются просто продуктом этого процесса формирования, и их распределение по размерам показано на рис. 4В. Однако это, скорее всего, чрезмерное упрощение, поскольку свойства синаптических каркасных доменов определенно отличаются от внесинаптических. Например, мы ожидаем, что они будут распространять даже меньше, чем большие внесинаптические каркасные домены. Это уменьшит их вероятность столкновения с другими доменами и, следовательно, их размер (моделирование с одним фиксированным доменом показывает уменьшение среднего размера на 33% по сравнению с рис. 4B).

В последние годы было обнаружено, что термодинамические фазовые переходы и фазовое разделение лежат в основе формирования различных клеточных безмембранных структур [36], в последнее время PSDs возбуждающих синапсов [37]. Одна особенность термодинамического разделения фаз заключается в том, что рост конденсированной фазы ограничивается только истощением конденсирующего компонента. Таким образом, размер образующейся структуры определяется размером ее «контейнера», а также общим количеством молекулярных компонентов, заключенных в нем [38].В клетках контейнером может быть вся клетка или одно из ее подразделений, например, позвоночник для возбуждающего PSD. Неравновесное разделение фаз может позволить клеткам избежать этого ограничения и сформировать локализованные структуры определенного размера, такие как PSD, независимо от размера компартмента, в котором они формируются, а именно всей мембраны нейрона для большинства тормозных синапсов. Агрегация с удалением или оборотом была предложена в различных клеточных контекстах [21, 23] помимо рассматриваемого здесь.Возникает соблазн предположить, что это конкретный, легко реализуемый механизм разделения фаз, выходящий за рамки термодинамического равновесия, обычно используемый клетками для формирования локализованных структур.

Наши результаты расширяют предыдущие работы, рассматривая неравновесную динамику рецепторов и каркасов на плазматической мембране. Хотя Haselwandter et al. [18, 19] рассмотрели общие непрерывные уравнения взаимодействия рецепторов и белков каркаса, они проанализировали другой динамический режим. Их математический анализ показал, что домены характерного размера могут быть получены с помощью неустойчивости типа Тьюринга.В этом случае кооперативное связывание белков каркаса в синаптических доменах ограничивается рецепторами, диффундирующими от домена, и стерическим отталкиванием между рецепторами. Однако неясно, подтверждаются ли все эти предположения в нейронах, поскольку, например, плотность рецепторов оказывается намного ниже насыщения на синаптических доменах [39, 40]. Более того, в этом режиме Тьюринга нельзя ожидать непрерывного диапазона размеров доменов. Бурлаков и др. [20] предложили модель, основанную на агрегации и удалении рецепторов, сходную по духу с моделью, описанной на рис. 1, но они не рассматривали каркасные белки или распределение кластеров по размерам.

В настоящем исследовании мы изучили простую модель формирования PSD с минимальным количеством параметров, большинство из которых определяется имеющимися данными. Тем не менее, некоторые из наших предположений, возможно, потребуют уточнения, когда появятся дополнительные данные. В нашей модели рецепторы действуют в основном как переносчики, которые обеспечивают латеральную диффузию каркасных частиц и доменов вдоль клеточной мембраны. Наша единая скорость k для удаления каркаса с мембраны учитывает как диссоциацию каркаса от рецепторов, так и эндоцитоз комплексов рецептор-каркас.В настоящее время этого кажется достаточно, но рецепторы, возможно, необходимо учитывать независимо от каркасов, если кто-то хочет более точно описать эти два процесса. Описание с множеством молекулярных видов также необходимо для описания концентрации рецепторов на доменах каркаса, его зависимости от сродства каркаса к рецептору, а также влияния рецепторов на стабильность домена каркаса. Также может потребоваться включение зависимости удаления каркаса от размера домена каркаса.

В основном мы рассмотрели предел, при котором домены каркаса очень эффективно перестраиваются и принимают сферическую компактную форму.Мы показали, что это не имеет значительных последствий для динамики кластеров и распределений по размерам, рассматривая другой крайний предел пренебрежимо малой перестройки кластера после агрегации каркаса, см. Рис. 2B. Однако форма отдельных кластеров каркаса действительно зависит от перегруппировки частиц каркаса внутри домена или от его отсутствия (см., Например, вставку на фиг. 2В). Хорошо известно, что в отсутствие рециклинга кластеры, которые растут за счет диффузии, склонны к нестабильности формы и что формы чувствительны к изменениям в динамике.Типичным примером является классическая модель агрегации, ограниченной диффузией (DLA) [41], где кластеры растут за счет необратимой агрегации очень разбавленных одиночных мономеров без перегруппировки. Такие кластеры принимают изотропные разветвленные формы с фрактальной размерностью d _f ≃ 1,7 для диффузии мономера в двух измерениях ( d = 2), как здесь рассматривается. Предпочтительные направления прикрепления или кристаллическая анизотропия делают кластеры анизотропными, как это обычно наблюдается со снежинками [42].Когда не только мономеры, но и кластеры диффундируют и агрегируют — случай, известный как агрегация кластер-кластер — образующиеся кластеры отличаются фрактальной размерностью d _f ≃ 1,45 [30]. Рост в растворе мономера конечной концентрации c ₀ делает кластеры DLA компактными выше характерной длины, которая зависит от c ₀ [30]. Кроме того, удаление мономеров вводит «диффузионную длину», выше которой кластеры также перестают быть фрактальными.С параметрами фиг. 3D, λ ≃ 5 мкм м намного больше, чем линейный размер синаптических доменов. Следовательно, будет интересной задачей для будущих исследований, как экспериментальных, так и теоретических, изучить удаление каркасного белка из каркасного домена и способы перестройки каркасного домена и связать их с наблюдаемыми формами, которые не кажутся ни круговыми, ни полностью фрактальными.

Сила синапса — одно из его ключевых свойств, поскольку оно контролирует эффективность передачи информации между нейронами.Однако, когда синапсы отслеживаются в течение нескольких дней, они претерпевают большие колебания в размере и молекулярном содержании. Это справедливо для нейронов, культивируемых in vitro , в отсутствие протоколов обучения и даже в отсутствие активности [43]. Было обнаружено, что феноменологическая модель, основанная на смешанном аддитивно-мультипликативном стохастическом процессе [44], хорошо объясняет зарегистрированные колебания размера возбуждающих [45], а также тормозных [46] синапсов. Интересно, что мы обнаружили здесь, что существование диффундирующих внесинаптических кластеров может обеспечить механистическое объяснение сходных флуктуаций размеров каркасных доменов в течение более коротких периодов.Прогнозируемое распределение флуктуирующих размеров доменов искажено (см. Рис. 4B) и качественно аналогично сообщенным (см., Например, рис. 4 в [46]).

Помимо спонтанных флуктуаций, выяснение механизмов, с помощью которых специфически модифицируется синаптическая сила, остается ключевой проблемой. Роль латеральной диффузии рецепторов в плазматической мембране в опосредовании изменений количества рецепторов в синапсе начали рассматривать в контексте синаптической пластичности [1, 8] и гомеостаза синаптической силы [47].Как латеральная подвижность GlyR в клеточной мембране, так и его сродство к связыванию с гефирином [48] можно регулировать. В рамках модели, которую мы предлагаем, это должно вызывать изменения не только в концентрации рецепторов на каркасных доменах, но также и в размере самих каркасных доменов, изменяя латеральный поток каркасных белков на домен. Время удаления каркасных белков является в нашей модели еще одним важным параметром, на который можно воздействовать, чтобы регулировать размер каркасного домена.В этом контексте можно отметить, что меньшие размеры гефириновых доменов наблюдались в однонедельных органотипических культурах по сравнению с четырехнедельными культурами [10], в то время как, соответственно, среднее время пребывания гефирина в каркасном домене было измерено как короче в однонедельных культурах, чем в четырехнедельных культурах [10]. Мы уверены, что модель с биофизическими корнями, такая как та, которую мы предлагаем здесь, предлагает новые взгляды на синаптическую динамику, гомеостаз и пластичность, которые будет полезно изучить в будущих работах.

Материалы и методы

Моделирование

Как описано в Результатах, мы реализовали две версии базовой модели, которые соответствуют двум пределам перегруппировки частиц внутри кластеров. В модели A частицы внутри данного кластера немедленно перестраиваются в диск с радиусом, заданным числом частиц n и типичной плотностью числа частиц в кластерах ρ ,. В модели B отдельные частицы не перестраиваются, а кластеры образуют фрактальные структуры.Обе модели по существу дают одинаковое распределение размеров кластеров, см. Рис. 2B. Если явно не указано иное, все представленные результаты моделирования были получены с моделью A по причинам уменьшения вычислительной сложности.

При моделировании все соответствующие величины и параметры выражаются в единицах длины l ₀ = a и времени t ₀ = a ² / D ₀ соответственно, где a — диаметр, а D ₀ — константа диффузии отдельной частицы.Первоначально N = c ₀ L ² частицы случайным образом распределены в пространстве в квадрате со стороной L , и мы используем периодические граничные условия повсюду. Диффузия и оборот частиц аппроксимируются дискретными временными шагами Δ t = 0,02 мал по сравнению с характерным временем t ₀ диффузии частиц. Во время каждого шага мы сначала обновляем положения частиц и кластеров, индексированные как i = 1,…, M , случайным приращением в соответствии с соответствующей постоянной диффузии D _i , т.е.е., приращения x и y, полученные из нормального распределения с дисперсией 2Δ tD _i и исчезающим средним. Частицы или кластеры, которые впоследствии перекрываются, сливаются, образуя кластер размером n _i + n _j , где n _i и n j размеры сливающихся кластеров / частиц и соответственно обновленный радиус. В конце концов, мы выводим количество десорбированных частиц на кластер в пределах одного временного шага из биномиального распределения с n _i независимых отрисовок, каждый из которых имеет вероятность Δ t k , и соответственно уменьшаем размеры и радиус кластера.Для простоты мы оставляем общее количество частиц в моделировании постоянным и вставляем столько новых, случайно распределенных частиц, сколько было удалено.

Моделирование обычно проводилось с N ≃ 10 ⁴ частицами, при этом размер коробки L изменялся соответственно для различных концентраций c ₀ . В нашем моделировании мы выбрали плотность кластеров ρ = 0,77 a ⁻² , что соответствует фракции упаковки гексагонального расположения; однако сравнение с моделированием фрактальных кластеров показывает, что результаты не сильно зависят от этого выбора.

Реагенты

Если не указано иное, все реагенты были приобретены у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури) или Life Technologies / Molecular Probes (Карлсбад, Калифорния).

Лентивирус

Лентивирус, кодирующий mEos2-Gephyrin, был получен путем котрансфекции плазмиды лентивирусного остова (FUGW), кодирующей конструкцию mEos2-Gephyrin (5 мк г) вместе с оболочкой pMD2.G (5 мк г) и упаковкой pCMVR8.74 (7,5 мкг г) плазмиды (Addgene, Кембридж, Массачусетс) в клетки HEK293T с использованием липофектамина 2000 (60 мкл мкл).Трансфекцию проводили в 10-см планшетах после того, как клетки достигли 80% слияния. Супернатант, содержащий лентивирус, собирали через 48 часов после трансфекции, фильтровали через фильтр с размером пор 0,45 мкм, мкм, разделяли на аликвоты и хранили при -80 ° C.

Культура клеток и инфекция

Все эксперименты проводили на культурах диссоциированных нейронов спинного мозга, полученных от крыс Sprague-Dawley (на E14). Эксперименты проводились в соответствии с Директивой Совета Европейских сообществ 2010 / 63EU от 22 сентября 2010 г. о защите животных, используемых в научных целях, и наши протоколы были одобрены комитетом Чарльза Дарвина в экспериментах на животных (Ce5 / 2012/018).Нейроны высевали с плотностью 6,3 × 10 ⁴ клеток / см ² на 18 мм покровные стекла, предварительно покрытые 70 мк г / мл поли-D, L-орнитина и 5% фетальной телячьей сывороткой. Культуры поддерживали в нейробазальной среде, содержащей B-27, 2 мМ глутамина, 5 ед / мл пенициллина и 5 мкл мкг / мл стрептомицина при 37 ° C и 5% CO ₂ . Нейроны инфицировали через 7 дней in vitro (DIV) рекомбинантным лентивирусным вектором, экспрессирующим конструкцию mEos2-Gephyrin.

PALM imaging

Фотоактивированную локализационную микроскопию (PALM) проводили на 14-17 DIV на нейронах, фиксированных 4% параформальдегидом и 1% сахарозой (10 мин).Все эксперименты по визуализации проводились на инвертированном микроскопе Nikon Eclipse Ti с иммерсионным объективом 100 × (N.A. 1.49), дополнительным объективом 1.5 × и камерой Andor iXon EMCCD. Фильмы со сверхвысоким разрешением были получены с частотой кадров 20 мс при непрерывном освещении с активационным (405 нм) и возбуждающим (561 нм) лазерами, всего 20000 кадров (6,7 минут). Плотность активации поддерживалась постоянной, вручную увеличивая интенсивность активационного лазера с течением времени. Обычную флуоресцентную визуализацию выполняли с помощью ртутной лампы и наборов фильтров для обнаружения предварительно преобразованного mEos2 (возбуждение 485/20, испускание 525/30).Положение z поддерживалось во время съемки системой идеальной фокусировки Nikon.

Обнаружение одиночных молекул и реконструкция ЛАДОМА

Координаты x и y детекций одиночных молекул из каждого кадра изображения были определены с использованием адаптированной версии алгоритма отслеживания нескольких целей [49], как описано ранее [50]. Сигналы функции рассеяния точки (PSF), испускаемые одиночными флуорофорами, соответствовали двумерному гауссовскому распределению. Дрейф в плоскости x / y был скорректирован путем расчета относительного движения центра масс нескольких кластеров синаптического гефирина (более 4 на поле зрения) на протяжении сбора данных с использованием скользящего окна в 3000-6000 кадров.Активации были сгруппированы с использованием одноканальной кластеризации с минимальным расстоянием 50 нм. Одиночные временные всплески в областях с низкой плотностью измерялись для точности определения местоположения и двойного счета, что позволяло подсчет молекул внутри кластеров. Области интересов были выбраны вручную из флуоресцентных изображений, так что для анализа концентрации по размеру были выбраны только кластеры внутри дендритов. Анализ выполнен на ( n = 3) культурах.

Подгонки моделированного распределения кластеров по размерам к экспериментальным данным

Чтобы сравнить экспериментально определенные распределения размера кластера с предсказанными распределениями для данного набора параметров S , мы определили вероятность данных согласно
(4)
где n _i = A _exp c _i ( S ) — это прогнозируемое количество кластеров размером i в наблюдаемой площади поверхности A _exp для заданных параметров S и # _i — это фактически определенное количество.Вероятность вычисляется, включая размеры вплоть до наибольшего наблюдаемого размера кластера i _max . Для каждой культуры ( n = 3) мы определили вероятность по сетке значений параметров, изменяющейся скорости оборота, степени зависимости от размера диффузии и общей концентрации. Предполагая, что последние могут различаться в разных культурах, мы определили совместную вероятность для всех трех культур j = 1, 2, 3 для параметров ( k , σ ), выбрав наиболее вероятный c ₀ для каждый ( k , σ ) независимо для каждой культуры.Подборы максимального правдоподобия отдельных кластеров показаны на рис. S3. Чтобы сравнить результаты экспериментов и моделирования, мы измерили концентрации по плотности частиц каркаса в кластерах, ( ρ = 5000/3 μ m ⁻² ) для экспериментов и ( ρ = 0,77 a ⁻² ) для моделирования соответственно. Мы предположили, что гефирин существует преимущественно в форме тримеров, и поэтому рассматривали тримеры гефирина как одночастичный элемент при подсчете размера кластера.Кроме того, мы ограничили сравнение прогнозируемого и фактического распределений размером кластера i ≥ 2, поскольку на счетчики более мелких кластеров больше влияют примеси и шум измерений. Прогнозируемые концентрации частиц были определены из стационарных решений скоростных уравнений, см. S1 Text: Rate Equations. Области достоверности, соответствующие 95% -ной вероятности оптимальных параметров соответствия, были получены методом бутстрэппинга с использованием повторной повторной выборки ( N = 10000) наблюдаемых кластеров для каждой из трех культур и применения описанной выше процедуры согласования к размеру повторно выбранных кластеров. раздачи.

Благодарности

Мы благодарим Бориса Барбура, Кристиана Шпехта, Кена Секимото и Раву А. да Силвейру за интересные обсуждения. VH также хотел бы поблагодарить Раву А. да Силвейру за стимулирование его интереса к этому вопросу и И Цуй за некоторые предварительные расчеты.

Вклад авторов

1. Концептуализация: JR LGA PCR AT VH.
2. Исследование: JR LGA PCR AT VH.
3. Написание — черновик: JR LGA PCR AT VH.

Ссылки

1. 1.

   Шоке Д., Триллер А. Динамический синапс. Нейрон. 2013; 80 (3): 691–703. pmid: 24183020

2. 2.

   Крик Ф. Нейробиология: память и молекулярный оборот. Природа. 1984; 312: 101.

3. 3.

   Розенберг М., Мейер Дж, Триллер А., Ванье С. Динамика вставки рецептора глицина в плазматическую мембрану нейронов. Журнал неврологии. 2001. 21 (14): 5036–5044. pmid: 11438579

4. 4.

   Томас П., Мортенсен М., Хози А.М., Смарт Т.Г.Динамическая подвижность функциональных рецепторов ГАМК в тормозных синапсах. Природа Неврологии. 2005. 8 (7): 889–897. pmid: 15951809

5. 5.

   Богданов Ю., Михельс Г., Армстронг-Голд С., Хейдон П. Г., Линдстром Дж., Пангалос М. и др. Синаптические рецепторы GABAA напрямую привлекаются из их внесинаптических аналогов. Журнал EMBO. 2006. 25 (18): 4381–4389. pmid: 16946701

6. 6.

   Specht CG, Izeddin I, Rodriguez PC, El Beheiry M, Rostaing P, Darzacq X и др. Количественная наноскопия тормозных синапсов: подсчет молекул гефирина и сайтов связывания рецепторов.Нейрон. 2013. 79 (2): 308–321. pmid: 23889935

7. 7.

   Kim EY, Schrader N, Smolinsky B, Bedet C, Vannier C, Schwarz G, et al. Расшифровка структурной основы закрепления рецептора глицина гефирином. Журнал EMBO. 2006. 25 (6): 1385–1395. pmid: 16511563

8. 8.

   Тягараджан С.К., Фритчи Дж. М.. Гефирин: главный регулятор функции нейронов. Nat Rev Neurosci. 2014. 15 (3): 141–156. pmid: 24552784

9. 9.

   Calamai M, Specht CG, Heller J, Alcor D, Machado P, Vannier C, et al.Олигомеризация гефирина контролирует подвижность GlyR и синаптическую кластеризацию. Журнал неврологии. 2009. 29 (24): 7639–7648. pmid: 19535575

10. 10.

    Влахос А., Редди-Алла С., Пападопулос Т., Деллер Т., Бец Х. Гомеостатическая регуляция гефириновых каркасов и синаптическая сила в зрелых ГАМКергических постсинапсах гиппокампа. Кора головного мозга. 2013. 23 (11): 2700–2711. pmid: 224

11. 11.

    Окабе С. Флуоресцентная визуализация формирования и ремоделирования синапсов. Микроскопия (Оксфорд, Англия).2013. 62 (1): 51–62.

12. 12.

    Schrader N, Kim EY, Winking J, Paulukat J, Schindelin H, Schwarz G. Биохимическая характеристика связывания с высоким сродством между рецептором глицина и гефирином. Журнал биологической химии. 2004. 279 (18): 18733–18741. pmid: 14976213

13. 13.

    Сола М., Бавро В.Н., Тимминс Дж., Франц Т., Рикар-Блюм С., Шон Г. и др. Структурные основы динамической кластеризации рецепторов глицина гефирином. Журнал EMBO. 2004. 23 (13): 2510–2519.pmid: 15201864

14. 14.

    Belaidi AA, Schwarz G. Встраивание металла в кофактор молибдена: формирование каналов продукт-субстрат демонстрирует функциональное происхождение слияния доменов в гефирине. Биохимический журнал. 2013. 450 (1): 149–157. pmid: 23163752

15. 15.

    Хервег Дж., Шварц Г. Сплайс-специфичное связывание рецептора глицина, сворачивание и фосфорилирование каркасного белка гефирина. Журнал биологической химии. 2012. 287 (16): 12645–12656. pmid: 22351777

16. 16.Ehrensperger MV, Hanus C, Vannier C, Triller A, Dahan M. Множественные состояния ассоциации между рецепторами глицина и гефирином, идентифицированные с помощью анализа SPT. Биофизический журнал. 2007. 92 (10): 3706–3718. pmid: 17293395
17. 17.

    Рибро К., Секимото К., Триллер А. От стохастичности молекулярных процессов до вариабельности синаптической передачи. Обзоры природы Неврология. 2011. 12 (7): 375–387. pmid: 21685931

18. 18.

    Haselwandter CA, Calamai M, Kardar M, Triller A, da Silveira RA.Формирование и стабильность доменов синаптических рецепторов. Письма с физическим обзором. 2011; 106 (23): 238104. pmid: 21770547

19. 19.

    Haselwandter CA, Kardar M, Triller A, da Silveira RA. Самосборка и пластичность синаптических доменов за счет механизма реакции-диффузии. Physical Review E. 2015; 92 (3): 032705.

20. 20.

    Бурлаков В., Эмптадж Н., Гориели А., Бресслофф П. Синаптическая бистабильность из-за зарождения и испарения рецепторных кластеров. Письма с физическим обзором.2012; 108 (2): 028101. pmid: 22324711

21. 21.

    Тернер М.С., Сенс П., Соччи Н.Д. Неравновесные рафтоподобные мембранные домены при непрерывной рециклинге. Письма с физическим обзором. 2005; 95 (16): 168301. pmid: 16241845

22. 22.

    Гомес Дж., Сагес Ф., Рейгада Р. Активно поддерживает липидные нанодомены в биомембранах. Physical Review E. 2008; 77 (2): 021907.

23. 23.

    Куанг БАТ, Мани М., Маркова О., Лекит Т., Ленне П.Ф. Принципы супрамолекулярной организации E-кадгерина in vivo.Текущая биология. 2013. 23 (22): 2197–2207.

24. 24.

    Shouval HZ. Кластеры взаимодействующих рецепторов могут стабилизировать синаптическую эффективность. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 2005. 102 (40): 14440–14445. pmid: 16189022

25. 25.

    Белый WH. О виде стационарных решений уравнений коагуляции. Журнал науки о коллоидах и интерфейсах. 1982; 87 (1): 204–208.

26. 26.

    Рац З. Агрегация в присутствии источников и стоков: теория масштабирования.Physical Review A. 1985; 32 (2): 1129–1133.

27. 27.

    Нуссер З., Робертс Дж., Бауде А., Ричардс Дж. Г., Сомоги П. Относительные плотности синаптических и внесинаптических рецепторов ГАМКА на гранулярных клетках мозжечка, определенные с помощью количественного метода иммунного золота. Журнал неврологии. 1995. 15 (4): 2948–2960. pmid: 7722639

28. 28.

    Саффман П., Дельбрюк М. Броуновское движение в биологических мембранах. Труды Национальной академии наук. 1975. 72 (8): 3111–3113.

29. 29.

    Гамбин Ю., Лопес-Эспарза Р., Реффай М., Сиерецки Е., губернатор Н., Дженест М. и др. Боковая подвижность белков в жидких мембранах. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 2006. 103 (7): 2098–2102. pmid: 16461891

30. 30.

    Микин П. Формирование фрактальных кластеров и сетей путем необратимой агрегации, ограниченной диффузией. Письма с физическим обзором. 1983. 51 (13): 1119–1122.

31. 31.

    Smoluchowski Mv.Grundriß der Koagulationskinetik kolloider Lösungen. Коллоидная и полимерная наука. 1917; 21 (3): 98–104.

32. 32.

    Зифф Р.М., МакГрейди Э., Микин П. О справедливости уравнения Смолуховского для кинетики кластер-кластерной агрегации. Журнал химической физики. 1985. 82 (11): 5269–5274.

33. 33.

    Дюмулен А., Леви С., Риво Б., Гаснье Б., Триллер А. Формирование смешанных глициновых и ГАМКергических синапсов в культивируемых нейронах спинного мозга. Европейский журнал нейробиологии.2000. 12 (11): 3883–3892. pmid: 11069583

34. 34.

    Помо И. Симетрия колебаний в изменении температуры. Journal de Physique. 1982. 43 (6): 859–867.

35. 35.

    Помо И., Ле Берр М., Жинибр Дж. Абсолютная статистическая физика: флуоресценция отдельного атома. Журнал статистической механики: теория и эксперимент. 2016; 2016 (10): 104002.

36. 36.

    Хайман А.А., Вебер К.А., Юлихер Ф. Разделение жидких и жидких фаз в биологии. Ежегодный обзор клеточной биологии и биологии развития.2014; 30: 39–58. pmid: 25288112

37. 37.

    Zeng M, Shang Y, Araki Y, Guo T., Huganir RL, Zhang M. Фазовый переход в постсинаптических плотностях лежит в основе формирования синаптических комплексов и синаптической пластичности. Клетка. 2016. 166 (5): 1163–1175. pmid: 27565345

38. 38.

    Brangwynne CP. Фазовые переходы и масштабирование безмембранных органелл. Журнал клеточной биологии. 2013. 203 (6): 875–881. pmid: 24368804

39. 39.

    Певица JH, Бергер AJ. Вклад одноканальных свойств во временной ход и амплитудную дисперсию квантовых токов глицина, регистрируемых в мотонейронах крыс.Журнал нейрофизиологии. 1999. 81 (4): 1608–1616. pmid: 10200197

40. 40.

    Риго Дж. М., Бадиу К. И., Лежандр П. Гетерогенность флуктуаций занятости постсинаптических рецепторов среди глицинергических ингибирующих синапсов в заднем мозге рыбок данио. Журнал физиологии. 2003; 553 (Pt 3): 819–832. pmid: 14500774

41. 41.

    Виттен Т.А., Сандер Л.М. Ограниченная диффузией агрегация, кинетическое критическое явление. Письма с физическим обзором. 1981. 47 (19): 1400–1403.

42. 42.Кесслер Д.А., Коплик Дж., Левин Х. Выбор модели в феномене пальчатого роста. Успехи физики. 1988. 37 (3): 255–339.
43. 43.

    Минерби А., Кахана Р., Гольдфельд Л., Кауфман М., Маром С., Зив НЕ. Долгосрочные отношения между синаптической устойчивостью, синаптическим ремоделированием и сетевой активностью. PLoS Biol. 2009; 7 (6): e1000136. pmid: 19554080

44. 44.

    Кестен Х. Случайные разностные уравнения и теория восстановления произведений случайных матриц. Acta Mathematica.1973; 131 (1): 207–248.

45. 45.

    Статман А., Кауфман М., Минерби А., Зив Н. Е., Бреннер Н. Динамика размера синапсов как эффективно стохастический процесс. PLoS Comput Biol. 2014; 10 (10): e1003846. pmid: 25275505

46. 46.

    Рубинский А, Зив NE. Ремоделирование и устойчивость тормозных синапсов: взаимосвязь с сетевой активностью и соседними возбуждающими синапсами. PLoS Comput Biol. 2015; 11 (11): e1004632. pmid: 26599330

47. 47.

    Татаварти V, Сан Q, Turrigiano GG.Как уменьшить постсинаптическую силу. Журнал неврологии. 2013. 33 (32): 13179–13189. pmid: 23926271

48. 48.

    Зита М.М., Маркионни И., Боттос Э., Риги М., Дель Сал Дж., Керубини Э. и др. Постфосфорилированная пролилизомеризация гефирина представляет собой механизм модуляции функции рецепторов глицина. Журнал EMBO. 2007. 26 (7): 1761–1771. pmid: 17347650

49. 49.

    Sergé A, Bertaux N, Rigneault H, Marguet D. Динамическое отслеживание нескольких целей для исследования пространственно-временной картографии клеточных мембран.Природные методы. 2008. 5 (8): 687–694. pmid: 18604216

50. 50.

    Изеддин I, Шпехт К.Г., Лелек М., Дарзак Х, Триллер А., Циммер С. и др. Динамическая визуализация дендритных шипов в сверхвысоком разрешении с использованием фотопреобразователя актина с низким сродством. ПлоС один. 2011; 6 (1): e15611. pmid: 21264214

Обзор AJFF: «Строительные леса» пересекают множество измерений

Старшеклассник из особого класса учеников с различными проблемами, Ашер — очаровательно импульсивный и неискаженный израильский подросток, пытающийся разгадывать свой путь к взрослой жизни.Он живет и работает со своим стойким, но эмоционально отстраненным отцом, который владеет строительной компанией и ценит тяжелый труд над домашним заданием.

В израильском фильме «Строительные леса» Ашер изо всех сил пытается найти баланс между этикой рабочего, которую он усвоил дома, и своей растущей верой в себя, что он может и должен завершить свое среднее образование и мечтать не только о наследовании семьи. бизнес.

Недооцененная большей частью общества, группа разношерстных учеников находит понимание и терпимость со стороны Рами, их терпеливого учителя литературы и единомышленников в его собственных вопросах.В Рами ученики находят признание и вдохновение и обретают желание достичь того, чего общество ожидает от них.

Получайте информационный бюллетень AJT по электронной почте и никогда не пропустите наши главные новости

Бесплатная регистрация

Название фильма не могло быть более удачным. В «Строительных лесах» отец Ашера представляет собой дисциплинированную основу для его жизни в дополнение к наследию семейного бизнеса, в то время как Рами раскрывает возможность другого пути.

Проницательный учитель побуждает Ашера задуматься и, в конце концов, задать вопросы о его отношениях и своей жизни, точно так же, как он стоит на краю пропасти взрослой жизни, пытаясь найти собственную опору.

Ашер Лакс играет главного героя фильма, а Ами Смолартчик — учитель средней школы Ашера. Матан Яир, учитель Лакса в реальной жизни, является сценаристом и режиссером фильма. В «Строительных лесах», как и в реальной жизни, учитель Ашера показывает, какое влияние один педагог может оказать на жизнь своих учеников за пределами классной комнаты.

Лакс проделал замечательную работу по изображению подростка, который может быть взрывным и тонким, вдумчивым и созерцательным. Выпущенный в мае прошлого года фильм «Строительные леса» получил четыре награды Израильской киноакадемии и Иерусалимского кинофестиваля в 2017 году, а также получил девять других номинаций.

Верный израильскому кинематографическому стилю, Яир предоставляет достаточно деталей, чтобы указать, куда может привести путь Ашера, не связывая вещи аккуратным бантом. Зрителю остается представить возможности Ашера, выходящие за рамки основного и показательного вывода фильма.

(показы на Еврейском кинофестивале в Атланте: 28 января, 19:55, Perimeter Pointe; 3 февраля, 13:00, Тара; 11 февраля, 11:00, Спрингс)

Модульные леса PERI UP Flex

Обзор

Для получения дополнительной информации о промышленных лесах PERI и программе комплексных строительных лесов PERI посетите:

Очень гибкая система строительных лесов PERI UP Flex почти не оставляет невыполненных запросов, особенно для промышленного применения.Он позволяет вносить практически любые корректировки в соответствии с местными условиями и отвечает самым высоким требованиям в отношении безопасности труда для рабочих зон.

PERI UP Flex имеет сетку размером 25 см и 50 см. Широкий ассортимент ригелей и настилов различной длины, начиная от 25 см, позволяет настилу изменять направление во время установки и, таким образом, обеспечивает максимальную адаптируемость к геометрии конкретного проекта. PERI UP Flex соответствует требованиям европейских стандартов EN 12810 и EN 12811

.

Такие же гибкие, как леса из труб / муфт
Безопасные условия труда
Рабочие платформы полностью закрыты, без зазоров, и их можно легко переоборудовать для устранения любых препятствий

Нескользящий
Перфорированная поверхность настила обеспечивает высокий уровень безопасности

Простота установки
Быстрая и безопасная установка с помощью «гравитационного замка» и самоблокирующихся настилов

Высокая несущая способность
За счет особой жесткости узла и огромной нагрузочной способности соединения

Технические детали

Краткое описание

• Гибкая модульная система строительных лесов с возможностью соединения по стандартам через каждые 50 см.Все компоненты с размером решетки 25 или 50 см допускают любую комбинацию.

Надежный и быстрый монтаж

• С предварительной сборкой с бухгалтерской книгой
• Встроенная блокировка против подъема
• Gravity Lock фиксирует бухгалтерскую книгу сразу после вставки в Rosett
• Прямоугольная розетка предотвращает откатывание

Классы нагрузки / соответствующая длина настила

• Ширина 75 см: от 1 до 4
• Ширина 100 см: от 1 до 6
• Ширина 125 см: от 1 до 4
• Стальной настил 25×250 см ≤ 5
• Стальной настил 25×300 см ≤ 4

Погрузочно-разгрузочные работы

• Стандарт 2,0 м: 10,0 кг
• Ригель 3,0 м: 8,7 кг
• Настил стальной 25×250 см: 15,0 кг
• Стальной настил 25×300 см: 17,8 кг

Пристройка к зданию

• Соединения ригеля с ригелем и стандартного ригеля обеспечивают такую ​​же гибкость, как и с трубными и соединительными лесами
• Возможны любые решения благодаря гибким размерам решетки

Транспорт

• Две бухгалтерские книги можно носить в каждой руке

Возможности подключения

• Метрическая сетка через каждые 25 см
• Узлы каждые 50 см
• 12 соединений для регистров и диагоналей

Предлагаемые услуги

• Строительные леса также можно арендовать по всему миру
• Супервайзер Техническая поддержка проектов

В качестве фасада строительных лесов

PERI UP Flex в качестве фасадных лесов
Гибкость строительных лесов PERI UP Flex позволяет варьировать ширину, адаптированную к соответствующим требованиям пользователя.С помощью нескольких дополнительных компонентов, таких как консольные кронштейны или усиленные ригели, можно легко возвести строительные леса сложной геометрии.

Модульные рабочие леса PERI UP Flex подходят для всех видов применения вплоть до класса нагрузки 6. Они соответствуют требованиям европейских стандартов EN 12810 и EN 12811

.

Краткое описание
Рабочие подмости из частей модульной системы подмостей Rosett различной ширины с нескользящим стальным настилом, непосредственно прикрепленным к ригелям!

Безопасная и быстрая сборка
Предварительная сборка с ограждением и муфтой для ограждения UPW или ригелем

Вес / м²
Ширина 100 см: 17,5 — 19,0 кг / м²

Производительность сборки
Сборка: ширина 100 см: 7-10 м² на человеко-час
Демонтаж: ширина 100 см: 11-16 м² на человеко-час

.

alexxlab